浸泡并過(guò)夜,第二天先用自來(lái)水沖洗20遍,再置于無(wú)水酒清中浸泡6小時(shí),再用三蒸水沖洗3遍(個(gè)人認為主要目的是將酸沖洗干凈就可以了,如果不干凈的話(huà),細胞帖壁不好),放在飯盒或者玻璃培養皿中烘干后進(jìn)行高壓消毒。高壓后取出放入烤箱中烤干,備用??靖珊罂煞湃氤瑑襞_中。
4.多聚賴(lài)氨酸的使用:
很多人都將玻片用此處理,以使細胞與玻片結合更牢。但我在做爬片時(shí)從來(lái)沒(méi)用過(guò)多聚賴(lài)氨酸,細胞貼壁仍然很好,且在做后續的免疫細胞化學(xué)染色、TUNEL等凋亡檢測、免疫熒光等也從未脫過(guò)片。
細胞爬片的操作
1.胰酶消化細胞后計數重懸細胞于培養基中。
2.加細胞前,根據玻片的大小,先在每個(gè)孔里準備放爬片的位置滴少量培養基,使玻片與培養皿靠培養基的張力粘合到一起,然后放玻片,防止加細胞懸液時(shí)玻片漂起,造成雙層細胞貼片。(整個(gè)過(guò)程注意無(wú)菌操作)
3.根據自己的需要選擇合適的細胞密度接入培養板內即可。
4.待細胞貼壁后,可去上清加含藥培養基。
5.按照實(shí)驗設計,作用一定時(shí)間后取玻片。取玻片時(shí)由于玻片與培養皿底結合較緊,張力較大,一般將注射器針頭針尖向背面弄個(gè)小鉤,這樣將爬片輕輕勾起,用小鑷子取出就可以了。如果要做諸如24h,48h,72h等這樣時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗的話(huà),將所需數量的爬片取出時(shí)應用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子。末取出的可接著(zhù)繼續培養。
細胞爬片的固定
另外在保存細胞爬片的時(shí)候,一般用培養皿或板,先在皿底放一層面巾紙,然后再放爬片,這樣方便做實(shí)驗時(shí)取片。
細胞爬片取出后,一般用PBS洗2遍,然后再做固定。當然,有例外,比如做凋亡的TUNEL染色時(shí)就避免洗,因為凋亡的細胞在洗的過(guò)程中有可能會(huì )脫落。
然后蓋上蓋子,并在蓋子上做標記,為避免混淆,可用透明膠帶將蓋子和皿連在一起。一般-20℃保存2-3個(gè)月的片子做免疫組化是沒(méi)有問(wèn)題的。