PCR反應條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數。

溫度與時(shí)間的設置：基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標準反應中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長(cháng)度為100～300bp時(shí))可采用二溫度點(diǎn)法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度TaqDNA酶仍有較高的催化活性)。

    ①變性溫度與時(shí)間：變性溫度低，解鏈不*是導致PCR失敗的主要原因。一般情況下，93℃～94℃min足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長(cháng)時(shí)間，但溫度不能過(guò)高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物*變性，就會(huì )導致PCR失敗。

    ②退火(復性)溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結合。由于模板DNA比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會(huì )遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(cháng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(cháng)度。對于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復性溫度可通過(guò)以下公式幫助選擇合適的溫度：

    Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

    復性溫度=Tm值-(5～10℃)

    在Tm值允許范圍內，選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性。復性時(shí)間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間*結合。

    ③延伸溫度與時(shí)間：TaqDNA聚合酶的生物學(xué)活性：

    70～80℃150核苷酸/S/酶分子

    70℃60核苷酸/S/酶分子

    55℃24核苷酸/S/酶分子

    高于90℃時(shí)，DNA合成幾乎不能進(jìn)行。

    PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。PCR延伸反應的時(shí)間，可根據待擴增片段的長(cháng)度而定，一般1Kb以?xún)鹊腄NA-片段，延伸時(shí)間1min是足夠的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過(guò)長(cháng)會(huì )導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時(shí)間要稍長(cháng)些。