細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時(shí)脫離生長(cháng)狀態(tài)而將其細胞特性保存起來(lái)，這樣在需要的時(shí)候再復蘇細胞用于實(shí)驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用。 

一、原理

在不加任何條件下直接凍存細胞時(shí)，細胞內和外環(huán)境中的水都會(huì )形成冰晶，能導致細胞內發(fā)生機械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養液加入保護劑，可使冰點(diǎn)降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水份在凍結前透出細胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。
細胞復蘇時(shí)速度要快，使之迅速通過(guò)細胞易受損的－5～0℃，細胞仍能生長(cháng)，活力受損不大。

目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細胞無(wú)毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。

二、細胞凍存與復蘇操作步驟

（一）凍存 

1、消化細胞（同實(shí)驗二），將細胞懸液收集至離心管中。
2、1000rpm離心10分鐘，棄上清液。
3、沉淀加含保護液的培養，計數，調整至5×106/ml左右。
4、將懸液分至凍存管中，每管1 ml。
5、將凍存管口封嚴。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴，否則復蘇時(shí)易出現爆裂。
6、貼上標簽，寫(xiě)明細胞種類(lèi)，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細繩。
7、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘)→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱(－30℃ 1小時(shí)）→氣態(tài)氮（30分鐘）→液氮。
注意：操作時(shí)應小心，以免液氮凍傷。液氮定期檢查，隨時(shí)補充，不能揮發(fā)干凈，一般30立升的液氮能用1～1.5月。

（二）復蘇 

1.  細胞實(shí)驗室進(jìn)行常規消毒，紫外照射40min以上。
2.  培養液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒溫水浴箱37°C預熱20min，備用。
3.  二甲基亞砜（DMSO)在40°C冰箱中冷藏30min，備用。
4.  從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入400°C水浴中，快速搖晃，直至凍存液*融化。
5.  將細胞懸液移入15ml離心管，緩慢加入4ml培養液，離心（1000r/min，5min）。
6.  用培養液懸液混懸沉淀細胞，調整細胞濃度，方培養箱中培養。
7.  記錄復蘇日期。
 
三、注意事項

1.  取細胞的過(guò)程中注意帶好防凍手套，護目鏡。此項尤為重要，細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時(shí)凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸。

2.  凍存液的問(wèn)題：凍存液的配置已是常識，在這里不作詳述，但二甲基亞砜（DMSO）對細胞不是*無(wú)毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對細胞的毒副作 較大，因此，必須在1-2min內使凍存液*融化。如果復蘇溫度太慢，會(huì )造成細胞的損傷，二甲基亞砜（DMSO）選擇進(jìn)口產(chǎn)品。

3.  離心前須加入少量培養液。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養液可稀釋其濃度，以減少對細胞的損傷。

4.  離心問(wèn)題：目前主要有兩種見(jiàn)解。一種是解凍后的細胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養瓶中進(jìn)行培養，第二天換液。因為離心的目的是兩個(gè)，去除 DMSO，去除死細胞，這個(gè)是標準流程，但對一般人來(lái)說(shuō)，把握不好離心轉速和時(shí)間，轉的不夠活細胞沉底的少，細胞就全被扔掉了，轉過(guò)了活細胞會(huì )受壓過(guò)大， 死亡。此外在操作過(guò)程中容易污染，所以不推薦。另一種說(shuō)法為細胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO），DMSO對細胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液 體前倒凈，且一定倒干凈。我在試驗中按照常規的離心分裝的方法進(jìn)行復蘇，結果無(wú)有異常。

5.  細胞貼壁少的問(wèn)題：教科書(shū)中說(shuō)明凍存細胞解凍時(shí)1ml細胞液要加10ml－15m培養液，而在我的試驗中的經(jīng)驗總結為培養基越少細胞越容易貼附。

6.  復蘇細胞分裝的問(wèn)題：試驗中我的經(jīng)驗總結為復蘇1管細胞一般可分裝到1-2只培養瓶中，分裝過(guò)多，細胞濃度過(guò)低，不利于細胞的貼壁。

7.  加培養基的量放入問(wèn)題：這個(gè)量的多少的把握主要涉及到的問(wèn)題是DMSO的濃度，從如果你加培養基的太少，那么DMSO的濃度就會(huì )比較大，就會(huì )影響 細胞生長(cháng)，從以前的資料來(lái)看，DMSO的濃度在小于0.5%的時(shí)候對一般細胞沒(méi)有什么影響，還有一個(gè)說(shuō)法是1％。所以如果你的凍存液的濃度是 10％DMSO的話(huà)那么加10ml以上的培養基就恰好稀釋到了無(wú)害濃度。