1.玻璃吸管和玻璃培養瓶的消毒:高壓蒸汽滅菌15分鐘以上;2)干烤消毒140度2小時(shí)以上;

2.無(wú)菌工作臺先清洗后用75%酒精擦拭干凈,紫外線(xiàn)照射40分鐘以上;各種培養板照射3小時(shí)以上;

3.培養基(pH7.2)和血清配制好后要做無(wú)菌試驗:將血清按10%加入培養基內,用無(wú)菌的玻璃離心管或玻璃瓶取*培養基5-10ml置培養箱內培養2-3天,肉眼見(jiàn)無(wú)渾濁或沉淀等異物.分裝后置-20度保存;

4.消化液(pH7.8)或其它加入液,應用高壓蒸汽滅菌或一次性無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌,分裝成支置-20度保存;

5.培養箱應先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍(如有紫外線(xiàn)的應照射1小時(shí)以上,如有高溫滅菌的應按程序來(lái)菌).至少每月一次.

6.進(jìn)入操作時(shí)應注意先清洗雙手及手腕,然后用75%酒精擦拭,操作時(shí)注意無(wú)菌臺內空間層次.手及物品不要在暴露的瓶口上方來(lái)往,如果數量較多,培養瓶應放在與酒精燈平行地方便于操作,瓶與瓶之間應相隔一定的距離,開(kāi)瓶(蓋)時(shí)應先用75%酒精反復擦拭或用燈燒,開(kāi)后應用燈先燒口,然后燒蓋.用完后同樣操作.整個(gè)操作過(guò)程盡量在無(wú)菌臺靠里面一點(diǎn).

傳代:

1.貼壁細胞:
對于貼壁細胞應先吸(倒)盡培養基,吸的越干凈越好,以免中和后加入的消化液,使強度減弱.50ml培養瓶加入消化液約0.6ml,按此比例進(jìn)行消化,(根據配制強度經(jīng)驗),晃動(dòng)使消化液鋪均勻置37度培養箱約2分鐘,鏡下見(jiàn)細胞收縮變圓或少數脫落后,輕輕振動(dòng)瓶底使細胞全部脫落,加入2-3ml*培養基后,輕輕吹打,使細胞基本成單個(gè)懸浮,然后分置其它無(wú)菌培養瓶?jì)?加入*培養基后繼續培養或實(shí)驗.

2.懸浮細胞:
一般傳代可直接將細胞原液分置其它培養瓶?jì)?加入*培養基繼續培養,如要高濃度可先離500rpm,5mi后加入*培養基,輕輕吹勻后,分置其它培養瓶?jì)燃尤?培養基繼續培養.

傳代細胞培養注意事項：

1.嚴格的無(wú)菌操作

2.適度消化：消化的時(shí)間受消化液的種類(lèi)、配制時(shí)間、加入培養瓶中的量等諸多因素的影響，消化過(guò)程中應該注意培養細胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化 。