BI北美胎牛血清

BI血清選擇指南

BI牛血清使用方法

在細胞培養過(guò)程中，經(jīng)常加入5%-20%的胎牛血清，常使用的BI胎牛血清濃度是10%。高濃度的血清可能改變細胞的基因表達譜，影響后續實(shí)驗的結果，我們在實(shí)驗中使用10%的BI澳洲胎牛血清培養293T細胞，效果非常好。但是有些細胞也會(huì )使用5%的BI FBS或者20%的BI胎牛血清，要根據具體 細胞選擇合適的BI胎牛血清濃度。

BI胎牛血清保存方法

1、需要長(cháng)期保存的BI胎牛血清(Bioind胎牛血清)必須儲存于-20℃ - 70℃ 低溫冰箱中。4℃冰箱中保存時(shí)間切勿超過(guò)1個(gè)月。切勿將血清在 37℃放置太久,否則血清會(huì )變得渾濁,同時(shí)血清中的有效成分會(huì )被破壞，而影響血清質(zhì)量。如果一次無(wú)法用完一瓶,可 將40～45ml分裝于無(wú)菌50ml離心管中。由于血清結冰時(shí)體積會(huì )增加約10%,因此,血清在凍入低溫冰箱前，必須預留一 定體積空間,否則易發(fā)生污染或玻璃瓶?jì)隽选?/span>

2、一般廠(chǎng)商提供的血清為無(wú)菌,無(wú)需再過(guò)濾除菌。如發(fā)現血清有懸浮物,則可將血清加入培養液內一起過(guò)濾,切勿直接 過(guò)濾血清。

3、瓶裝血清解凍需采用逐步解凍法:-20℃ 至 -70℃ 低溫冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1天.然后移入室溫,待全 部溶解后再分裝,一般以50ml無(wú)菌離心管可分裝40～45ml。在溶解過(guò)程中須規則搖晃均勻(小心勿造成氣泡),使溫度 與成分均一,減少沈淀的發(fā)生。.切勿直接將血清從-20℃進(jìn)入37℃解凍,這樣因溫度改變太大,容易造成蛋白質(zhì)凝集而 出現沉淀。

4、熱滅活是指56℃, 30分鐘加熱已*解凍的血清.加熱過(guò)程中須規則搖晃均勻.此熱處理的目的是使血清中的補體 成分滅活.除非必須,一般不建議作此熱處理,因為熱處理會(huì )造成血清沉淀物顯著(zhù)增多,而且還會(huì )影響血清的質(zhì)量.補體 參與反應有:細胞毒作用, 平滑肌細胞收縮, 肥大細胞和血小板釋放組胺, 增強吞噬作用, 促進(jìn)淋巴細胞和巨噬細胞 發(fā)生化學(xué)趨化和活化。

5、血清中的沉淀物 絮狀物:主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成,這些絮狀物不會(huì )影響血清本身 的質(zhì)量.可用離心3000rpm,5分鐘去除,也可不用處理。 顯微鏡下"小黑點(diǎn)":經(jīng)過(guò)熱處理過(guò)的血清,沉淀物 的形成會(huì )顯著(zhù)增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀(guān)察象"小黑點(diǎn)",常誤認為血清受污染。一般情況下,此小黑 點(diǎn)不會(huì )影響細胞生長(cháng),但如果懷疑血清質(zhì)量,則應立即停止使用,更換另一批號的血清。

BI胎牛血清使用中遇到的常見(jiàn)問(wèn)題總結

一、BI血清滅活問(wèn)題。

1、問(wèn)：加到培養基中的BI牛血清必須滅活嗎？

答：不是必須的，看做什么實(shí)驗了。

2、問(wèn)：BI胎牛血清(Bioind胎牛血清)滅活是56℃ 30分鐘嗎？

答：如果用于培養大多數的腫瘤細胞，血清一般是不需要滅活的，這樣可以有效保存血清中的生長(cháng)因子。 但是如果用于培養一些表面具有補體受體的細胞，如內皮細胞，血清是需要滅活，一般是56℃，30min。

3、問(wèn)：我要做滋養細胞培養，胎牛血清要滅活嗎？

答：進(jìn)口的一般都已滅活，國產(chǎn)的不一定，還是滅活一下再用較安全。

4、問(wèn)：我用病毒上清轉染細胞，培養用的血清需要滅活嗎？因為血清中可能有些補體和抗體，是不是會(huì )影 響轉染？我想未滅活的血清中含些抗體補體可能會(huì )和病毒相結合，影響轉染，正確嗎？細胞是單核細胞白血病細胞， 病毒是病毒包裝細胞PT67收集的病毒上清。為什么要用無(wú)血清培養基加病毒孵育幾小時(shí)，目的是什么？

答：血清一定要滅活，可以先用無(wú)血清培養基加病毒孵育幾小時(shí)以后再加血清。避免雜蛋白對病毒和宿主 結合過(guò)程的干擾，一般是2-6小時(shí)，根據細胞的狀態(tài)決定。血清不一定需要滅活，滅活的目的是將血清中的補體滅活 ！這要根據實(shí)際情況而定，如果沒(méi)有把握那就滅活吧，也不麻煩56度半個(gè)小時(shí)。

5、問(wèn)：(1)我買(mǎi)的是BI南美胎牛血清(Bioind南美胎牛血清)，要滅活嗎？有些說(shuō)法是需要，有些說(shuō)直接解凍后就可以加入到培 養基中；我配制胰蛋白酶液，用的是D-PBS，有關(guān)系嗎？

答：關(guān)于血清的熱滅活，是很多人感興趣也存在一定爭議的話(huà)題。大多數實(shí)驗室將血清的熱滅活還是作為 常規來(lái)執行，因為有兩個(gè)作用，一是滅活補體，第二是滅活血清中可能存在的支原體。但是實(shí)驗者并沒(méi)有考慮熱處 理對血清中的生長(cháng)因子、氨基酸等成分帶來(lái)的負面影響。

我在實(shí)驗室處理血清的時(shí)候，有一次水浴箱在滅活過(guò)程中出現故障，溫度升高到80℃，血清變成了凝膠狀 ，我重新處理了另外一份血清，將兩份血清對比，發(fā)現高溫直接影響到血清所含的抗體蛋白。在56℃下滅活半小時(shí)以 上，肯定也會(huì )對里面的蛋白起到破壞作用。下次有機會(huì )我做個(gè)延長(cháng)滅活時(shí)間的實(shí)驗試試，看看到底有多大的影響。熱 滅活之后，血清放在四度冰箱久了，就會(huì )有沉淀產(chǎn)生，這常常會(huì )被認為是微生物污染或者是黑膠蟲(chóng)污染。為了驗證到 底有沒(méi)有污染，常常又會(huì )把血清放置37℃溫育，但是血清中的蛋白會(huì )進(jìn)一步析出，后還是要做鏡檢，無(wú)菌培養試驗 ，和革蘭氏染色試驗，非常麻煩。

我看過(guò)一份資料，里面提到70%的實(shí)驗者認為滅活是理所當然的。常規滅活建議的溫度在45℃到62℃之間， 而時(shí)間則從15分鐘到60分鐘不等。其中常用的手法是56℃熱處理30分鐘。隨著(zhù)血清采集、處理、加工工藝的提高 ，許多早先認為是熱滅活的原因已經(jīng)不再成立，只有少數對血清進(jìn)行熱滅活的研究者在實(shí)驗中證實(shí)了這一步驟的有效 性和必要性。有人比較過(guò)11個(gè)不同細胞株，發(fā)現其中熱滅活對6 個(gè)細胞株(HBAE，MDBK，Vero，成纖維細胞，MRC-5) 的生長(cháng)帶來(lái)負面影響，三個(gè)細胞株(FOX-NY，MDCK和CHO-K1)不受熱滅活的影響，而只有兩個(gè)細胞株(Balb/3T3， Sp2/0Ag14 hybrid)，在熱滅活之后，細胞生長(cháng)有輕微的改善。所以，在正常的操作下，熱滅活通常對細胞的生長(cháng)沒(méi) 有明顯的促進(jìn)作用。

你可以摸索一下，血清從-20℃冰箱拿出來(lái)之后在常溫解凍，然后混勻分裝成兩份，一份滅活，一份不滅活 ，比較這兩種血清對細胞是否有影響。然后再確定是滅活還是不滅活。這個(gè)過(guò)程多也就一個(gè)星期。同時(shí)你還要考慮 血清滅活與否對你后續的實(shí)驗有沒(méi)有影響。

問(wèn)：(2)分裝后的BI胎牛血清南美從-20℃取出放4℃讓其液化，卻見(jiàn)血清比較混濁，有沉淀產(chǎn)生，這屬正常嗎？

答：正常。

二、BI牛血清的保存問(wèn)題。

1、問(wèn)：2016年6月到期的BI血清(Bioind血清)到2017年5月還能用嗎？

答：只有試試了，如果一直在-20℃凍著(zhù)來(lái)者，應該還可以，先少用點(diǎn)看看。養細胞系應該沒(méi)問(wèn)題，原代不 行。

2、問(wèn)：請問(wèn)我自然溶化好的胎牛血清和1640培養基今天用不上，明天用，我不想放到冰箱里，放在室溫下 一晚行嗎？100毫升培養瓶加多少培養基呢？

答：可以放4℃。4-5ml。

3、問(wèn)：4℃冰箱內保存3個(gè)月的BI北美胎牛血清，能否繼續使用？相關(guān)細胞和其它試劑的代價(jià)比較高，不敢輕易嘗 試。

答：需要長(cháng)期保存的BI胎牛血清(Bioind胎牛血清)必須要保存在-20至-70℃的低溫冰箱中，4℃冰箱中保存時(shí)間不要超過(guò)1 個(gè)月。

三、血清滅活時(shí)溫度問(wèn)題。

1、問(wèn)：因為實(shí)驗室水浴鍋失控，血清滅活時(shí)，溫度到了61.7℃，這血清還能用嗎？

答：多長(cháng)時(shí)間??？短時(shí)間應該可以吧，我有一次加熱了一個(gè)多小時(shí)，還照樣用。

2、問(wèn)：我滅活胎牛血清時(shí)，用的電磁爐，定在了70℃，本來(lái)說(shuō)調溫度到56℃再放血清的，后來(lái)忘了，就把 血清放進(jìn)去了，所以滅活的溫度肯定超過(guò)56℃了，不知道這樣對血清有沒(méi)有影響？

答：常規滅活建議的溫度在45℃到62℃之間，而時(shí)間則從15分鐘到60分鐘不等，其中常用的手法是56℃ 熱處理30分鐘?？纯茨沭B的細胞是什么，一般的話(huà)估計問(wèn)題不大，要是很珍貴的細胞還是慎重一點(diǎn)啊。熱滅活目的是 為了去除血清中補體等對熱敏感的物質(zhì)， 在對補體滅活以外，熱處理同時(shí)也對血清中可能存在的支原體具有滅活作 用?，F在好像不主張熱滅活，熱滅活經(jīng)常給血清產(chǎn)品帶來(lái)負面影響，對血清的加熱經(jīng)常導致血清中沉淀的產(chǎn)生，此外 ，有研究結果證實(shí)熱滅活步驟減弱了胎牛血清和小牛血清對細胞的促粘附作用。

四、FBS可否代替人AB型血清？

問(wèn)：我現在在做人的外周血b淋巴細胞的培養，文獻上要求用人的AB型血清，但是我覺(jué)得很多代理商都沒(méi)有 。我想FBS代替，但不知道可否，我先是擔心免疫排斥之類(lèi)，但是我查了些資料后，應該不會(huì )(我覺(jué)得)。但是我又不 能夠TRY。因為細胞因子確實(shí)太貴了，所以咨詢(xún)一下。謝謝！

答：你照文獻的做。除非你系列實(shí)驗證明你用代用品的結果與文獻的相同(你還是要用到文獻的試劑) 。細胞培養的影響因素很多，特別是培養基的成分。

五、血清的制備方法問(wèn)題。

1、問(wèn)：我的實(shí)驗需要自己制備一些血清用于培養細胞，有沒(méi)有人知道用于培養細胞的血清需要怎樣的制備 過(guò)程？

答：自己制備血清當心污染啊。如果無(wú)菌條件好的話(huà)，用靜置析出方法就行。

2、問(wèn)：一般我們用得胎牛血清用前還要滅活，我想用大鼠的血，不知道要不要滅活？

答：你直接把采來(lái)的血液在離心管里4℃過(guò)夜，離心，取上清，在無(wú)菌過(guò)濾，也可滅活，然后分裝凍存，用 時(shí)再配。

3、問(wèn)：如果滅活會(huì )不會(huì )對BI胎牛血清北美中的一些因子有損傷？

答：加熱可以滅活補體系統。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺， 激活淋巴細胞和巨噬細胞。在進(jìn)行免疫學(xué)研究、培養ES細胞、昆蟲(chóng)細胞和平滑肌細胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。滅活 一般不會(huì )對血清中的一些因子損傷的。

六、心肌細胞原代培養時(shí)BI胚胎干細胞胎牛血清的使用問(wèn)題。

1、問(wèn)：在進(jìn)行心肌細胞原代培養時(shí)，需要用含BI胚胎干細胞血清的培養基中止胰酶的消化作用，我現在使用的是含血清 10%的培養液，但近日看北醫一個(gè)細胞培養的課件發(fā)現，有用1%血清培養液進(jìn)行中止消化的，想問(wèn)一下，1%的是否可 以，效果是否有保證？這樣確實(shí)能節省不少血清的。

答：關(guān)于心肌細胞元代培養的FBS問(wèn)題：

(1)1%的血清*培養基可不可以，得看你胰酶的用量。但是在心肌細胞元代培養就不行。 10%的FBS* 培養基效果都不太好，開(kāi)始心肌細胞元代培養需要高濃度的FBS，20%左右，但這就有出現另一個(gè)問(wèn)題，在FBS*培 養基中，成纖維細胞呈優(yōu)勢細胞，須得在培養基加入適量的BrdU以抑制其生長(cháng)，純化心肌細胞。

(2)FBS的作用不僅僅是拿來(lái)中和胰酶，只是FBS中的一些蛋白質(zhì)如α-巨球蛋白等有抑制胰酶活性作用 。

(3)元代心肌細胞培養的BI間充質(zhì)干細胞胎牛血清使用，有講究：剛開(kāi)始使用20%左右的高濃度的FBS，后逐漸遞減為無(wú)血清的 DMEM/F-12培養基培養。

2、問(wèn)：我胰酶的用量是0.08% ，并混和了0.08%的膠原酶。FBS要高濃度遞減是否是說(shuō)的在細胞培養中啊， 難道在消化時(shí)終止也需要如此高的濃度嗎，還有，我的BRDU只用到48小時(shí)就不用了，因為擔心其損傷太大，可以持續 用多久呢？

答：我用10%FBS終止的，然后差速1h，然后還是用10%FBS的HG-dmem養的，沒(méi)有用brdu，心肌細胞還是比 較多和穩定的，我第3天就可以用，第2天晚上看就會(huì )有搏動(dòng)。

七、血清和培養基的種類(lèi)及品牌問(wèn)題。

1、問(wèn)：細胞培養的胎牛血清用哪個(gè)公司的產(chǎn)品比較好呢？周?chē)腥擞肞AA或Hyclone的，這兩種跟Gibco或BI血清出品的差別大嗎？

答：如果是長(cháng)得非?？斓眉毎鏿a317，293，c6等惡性腫瘤細胞，一般得國產(chǎn)血清就可以，如果是原代培 養的細胞，應用胎牛血清或類(lèi)標準胎牛血清，Hyclone公司血清的質(zhì)量不如GIBCO(同類(lèi)血清)。國產(chǎn)的杭州四季 青和甘肅民海（中美和資）不錯。有些細胞(如：sf9，293還有其他一些元代細胞)，用Gibco的比其他兩種好很多， 會(huì )大大加速試驗進(jìn)度。對于其他一些細胞(如：vero，MDCK，pk)四季青，Hyclone的小牛血清足矣！另外，Gibco的 還要看產(chǎn)地。

2、問(wèn)：近要訂一瓶BI間充質(zhì)細胞胎牛血清，實(shí)驗室之前都在用小牛血清，沒(méi)有買(mǎi)過(guò)胎牛血清。請問(wèn)哪個(gè)公司的好一些 ？問(wèn)過(guò)試劑公司，有兩種：一種是PAA的(分普通級和優(yōu)級)，一種是Hyclone的(只有普通級，而且是新西蘭產(chǎn)的)。 試劑公司推薦使用PAA優(yōu)級的，但看好多文獻都用Hyclone的，公司說(shuō)是因為現在Hyclone的都不是美國進(jìn)口的了。請 問(wèn)用的哪種胎牛血清比較好？

答：民海的效果還不錯，要是不放心國產(chǎn)的，那就買(mǎi)進(jìn)口的。進(jìn)口的好多公司都有，新西蘭產(chǎn)的效果一般 。BI胎牛血清(Bioind胎牛血清)還可以。民海的似乎比四季青的要好些。復蒙的感覺(jué)也不錯。

3、問(wèn)：四季青“無(wú)噬菌體、低內毒素胎牛血清”與“無(wú)支原體胎牛血清”的區別 ？培養腫瘤傳代細胞用哪一個(gè)比較好些？

答：用無(wú)支原體胎牛血清就可以啦。

4、問(wèn)：SKBR-3細胞培養用哪種型號的1640培養基及胎牛血清？

答：我一直用GIBCO的1640，你可以買(mǎi)含HEPES的1*10L的包裝，胎牛血清也是用的GIBCO，10%就行。

八、牛血清污染噬菌體的問(wèn)題。

1、問(wèn)：有誰(shuí)知道小牛血清制造過(guò)程中怎樣能夠避免噬菌體的污染，以及對已污染噬菌體的牛血清怎樣能夠 除去噬菌體？

2、問(wèn)：我也想知道，我用的血清中大部分都有噬菌體，它對細胞培養到底有什么影響？

暫無(wú)回答。

九、培養基血清濃度問(wèn)題。

問(wèn)：在1640里加血清時(shí)加多了，90ml里加了20ml血清，約為18%，以前都是加10ml的，查了網(wǎng)上多建議用 10%-15%，有關(guān)系嗎？

答：我認為一般來(lái)說(shuō)血清濃度的較大波動(dòng)對細胞的狀態(tài)影響較大，建議再加90ml1640調成10%。血清濃度大 當然細胞狀態(tài)感覺(jué)要好，但是高濃度的血清可能改變細胞的基因表達譜，影響后續實(shí)驗的結果。10%的濃度培養鼻煙 癌細胞很好。

十、問(wèn)：MTT加藥的時(shí)候加不加血清？加藥時(shí)要用無(wú)血清的培養基嗎？

答：我的藥就是用含血清的培養基稀釋的，不含血清的培養基對細胞有毒性或抑制作用，無(wú)形中對細胞造 了一個(gè)serum-free的模型，細胞在提內本來(lái)就是有血清供應，如果該藥物都不能對抗，那該藥物就沒(méi)有什么臨床價(jià) 值了，這是我的理解。

十一、PC12細胞培養所用血清問(wèn)題。

問(wèn)：我正準備購買(mǎi)上海細胞所的未分化的PC12細胞，需要滅活的馬血清，可現在買(mǎi)血清很困難，好像是海 關(guān)有封鎖，代理商這么說(shuō)的，我原定購買(mǎi)的Gibco的horse surum，現在無(wú)法買(mǎi)到了，好容易找到一個(gè)目前可以進(jìn)血 清的公司Hyclone，有一種Donor Equine serum是馬血清嗎？

答：Hyclone的Donor Equine serum可以用，我以前用的就是這個(gè)。我當時(shí)是在鼎國(重慶辦事處)買(mǎi)的， 100ml大概140元，具體不記得了。當時(shí)是看它比別的進(jìn)口的馬血清便宜。另外：我買(mǎi)了以后滅活的。

十二、AB血清的制備問(wèn)題。

問(wèn)：本人想從人的外周血中分離AB血清的，用于B淋巴細胞的培養。謝謝大家給點(diǎn)建議。人的血，來(lái)之不易 啊。

答：是AB血型人的血清嗎？這種血清即沒(méi)有抗A型抗原抗體，也沒(méi)有抗B型抗原抗體。分離血清時(shí)將采集的 血液注入試管中，待血液凝固后離心分離血清?？蓪⒉杉难悍旁?7℃水浴箱中促進(jìn)血液凝固，減少凝固時(shí)間。離 心可在2500～3000rpm，10min，足可以分離血清。分離后將血清吸出保存即可。分離血清的量可按采集血液的50%左 右計算，因為紅細胞占總血液的50%左右。當然整個(gè)過(guò)程要注意無(wú)菌操作。

十三、BI胎牛血清內是否含糖？

問(wèn)：我想做糖誘導細胞凋亡的試驗。細胞培養液里加入了20%的胎牛血清。因此胎牛血清里是否含有糖對我 實(shí)驗的培養液糖終濃度影響比較大。今天打電話(huà)問(wèn)GIBCO公司的技術(shù)顧問(wèn)，回答我糖濃度少于5μg/ml，因此基本 可認為是不含糖。但我今天把胎牛血清送到我們醫院檢液科，結果卻是：6.2mmmol/l(葡萄糖氧化酶法)。難道是檢 測人血清的血糖濃度的方法不能用于檢查牛血清嗎？(另起茶水驗尿事件？)檢驗科沒(méi)有給我回答。

答：應該是不含糖的。

十四、血清或培養基產(chǎn)生了顏色或沉淀的問(wèn)題：

1、問(wèn)：我用的是BI南美胎牛血清，56℃30分鐘滅活后出現了白色少量絮狀沉淀，是不是污染？還能不能 再用？血清的生產(chǎn)日期是2006年7月(現在是2007年6月11日)。

答：應該問(wèn)題不大。你可以取少量血清放入培養皿中，37℃過(guò)夜培養看看就知道是否污染了。血清中沉淀 物的出現有許多種原因，但普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在 血渭解凍后，也會(huì )存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。 若您欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無(wú)菌離心管內，以400g稍微離心，上清液即可接著(zhù)加入培養基內一起 過(guò)濾。

2、問(wèn)：我用MTT法測細胞的增殖，用DMSO裂解細胞，發(fā)現把DMSO加入到孔中就會(huì )形成乳白色(用的含胎牛血 清的1640培養基，由于沒(méi)有離板子的離心機，所以沒(méi)有去除培養基直接加的DMSO)。以前用含小牛血清的培養基沒(méi)有 看到有這種情況。該怎么解決？

答：為什么要用離心機離心呢？難倒你養的是懸浮細胞嗎？如果是貼壁細胞的話(huà)直接將MTT倒掉，再加DMSO 即可，我們就是這么做的，效果很好！并且測細胞的增殖的話(huà)如果不去掉MTT就加DMSO的話(huà)誤差應該很大！有時(shí)不一 定就是血清的原因，可能跟你的MTT放置的時(shí)間或以及其他成分有關(guān)！

3、問(wèn)：(1)BI胎牛血清(Bioind胎牛血清)500ml，今天解凍后沒(méi)有混勻直接分裝，結果使得前面的幾管是清亮的，后面就 帶有棕色的，不知有沒(méi)有影響？估計有什么影響？前面的成分好還是棕色的成分好??？

答：肯定有。還是重新混合重新分裝，我覺(jué)得有效成分會(huì )集中在棕顏色部分。

問(wèn)：(2)為什么會(huì )出現棕色呢？

答：BI胎牛血清(Bioind胎牛血清)中的棕色多一些可能是因為紅蛋白的含量高些的緣故吧。

問(wèn)：(3)血清滅活之后可以存放嗎？我的是前天滅活的，但是沒(méi)有加到培養基里，而是放在冰箱里，那下次 可以直接用嗎？還是再次滅活??？

答：當然可以，如果多的話(huà)，分裝后放在－20℃，下次用時(shí)再解凍，也不用再滅活。用一管拿一 管，少許血清可以放在4℃。分裝時(shí)還要注意不要裝得太滿(mǎn)，以免溢出污染。

十五、污染和過(guò)濾的問(wèn)題。

1、問(wèn)：懷疑血清染菌，想用濾膜過(guò)濾一下，可否自己用0.22μm濾膜過(guò)濾？對血清性質(zhì)有多大影響？有 做過(guò)的么？

答：可以過(guò)濾的，血清當出廠(chǎng)時(shí)都是0.22μm或0.1μm過(guò)濾除菌。想證明有沒(méi)有染菌不用過(guò)濾這么麻煩 ，只要放置于37℃過(guò)夜就可以了，如果有微生物污染會(huì )變渾濁的，如果還是澄清的就說(shuō)明沒(méi)有問(wèn)題的。實(shí)驗室中血清 很難直接過(guò)濾，一般要加到培養基中再過(guò)濾。我們實(shí)驗室制備培養基時(shí)，都使用濾膜過(guò)濾，一般而言如果制備1-2瓶 培養基，一個(gè)濾膜及一支30ml注射器可以過(guò)濾50ml小牛血清。如果大量制備培養基也可以將血清加到培養基中，使 用0.22微米的大濾膜一起過(guò)濾。

2、問(wèn)：我懷疑我用的*1640培養液被污染了，準備重新過(guò)濾消毒，過(guò)濾后是否需要補充胎牛血清？如需 又如何補充？

答：*1640培養液被污染了，如果是支原體的話(huà)，過(guò)濾沒(méi)有作用，支原體可以通過(guò)濾膜。我們用1640液 ，都是配液后保留500ml，然后其他的分裝100-200ml，現用現配因為血清比1640要貴，如果你想過(guò)濾的話(huà)，建議你 加原比例血清，因為血清不會(huì )很容易通過(guò)濾膜。主要的還是找到可能污染的原因。

3、問(wèn)：加好了血清雙抗的培養基由于污染了再過(guò)濾后還能用嗎？

答：建議不要用了。在加了雙抗的情況下已經(jīng)污染，那么細菌污染的可能性會(huì )較小了。一般的過(guò)濾除不能 去除病毒或者部分真菌的污染的。

4、問(wèn)：我準備把使用的*1640培養液重新過(guò)濾一遍，不知道培養液中的血清成分是否能通過(guò)濾膜，過(guò)濾 后是否還需要補充胎牛血清？如需又如何補充？

答：可以透過(guò)，但是隨著(zhù)液體量的增多會(huì )很慢，如果不加壓會(huì )比較麻煩，還有用低蛋白吸附的，不然 損失是比較大的。

十六、問(wèn)：懸浮細胞培養時(shí)能否加血清？如果加了會(huì )有什么結果？為什么懸浮細胞培養時(shí)就不能加血清？

答：血清是細胞培養基中重要的培養成份之一，對細胞生長(cháng)有廣泛影響。在細胞培養時(shí)，我們通常會(huì )加入 10%的血清。血清的質(zhì)量對細胞培養的成功至關(guān)重要。一般說(shuō)來(lái)，牛血清包括以下成分：生長(cháng)因子(如激素，白細胞介 素等)，他們可以促進(jìn)細胞生長(cháng)；貼附因子，他們可以促進(jìn)細胞的貼壁，往往只有細胞貼壁才能增值(懸浮培養的細胞 除外)；蛋白質(zhì)(如血清白蛋白，球蛋白等)，既可以作為營(yíng)養物質(zhì)，又可以中止胰酶的作用；還有很多成分不明的物 質(zhì)。血清還可以起到解毒作用，如脂肪酸、重金屬和某些蛋白酶的毒性。血清還可以是細胞免受機械損傷。因此，無(wú) 論是貼壁細胞還是懸浮細胞，血清是*的。除非因實(shí)驗要求無(wú)血清培養時(shí)，例如：為使細胞同步化時(shí)，我們會(huì ) 采用無(wú)血清培養的。單純的說(shuō)懸浮細胞培養不能加血清就沒(méi)有太多的道理了。

十七、關(guān)于中和消化液需要的血清量。

問(wèn)：用胰蛋白酶消化細胞后，需要用血清中和。具體這種中和作用所要求的胰蛋白酶和血清之間的比例是 多少？

答：做了很久的試驗，真的沒(méi)有想過(guò)胰酶和血清的對應關(guān)系。不過(guò)細想下來(lái)，這個(gè)應該也沒(méi)有固定的比值 。血清的品種都是不同的，成分必然有差異，如何能確定其與胰酶的比值關(guān)系？我們消化細胞的時(shí)候，如果是傳代， 細胞變形后，吸出胰酶直接加入適量的hanks液或者全培，這個(gè)量看自己的喜好和吹打細胞方便而定。一般都可以中 止消化的。不會(huì )存在繼續消化的事情。如果是從組織上消化細胞做原代培養，我一般都使用全培進(jìn)行中止，而且加的 很多，0.25%的胰酶，用10%血清，按1:2的比例應該是足夠的。當然全培是2，一般我養細胞的時(shí)候，會(huì )用國產(chǎn)的比 較便宜的血清配制全培，專(zhuān)門(mén)用于中止消化，這樣有幾個(gè)好處：一是中止消化的效果應該好于hanks液吧，再是也有 利于維持細胞活性。而且這部分液體會(huì )被離心去掉，血清便宜，離心掉了不會(huì )心疼。而養細胞的時(shí)候用好血清。個(gè)人 觀(guān)點(diǎn)，僅供參考。

十八、BI牛血清中的懸浮物問(wèn)題。

1、問(wèn)：發(fā)現培養的細胞瓶中背景有許多的小黑點(diǎn)，培養液中也有一些漂浮的物?？戳酥暗奶詾槭悄z原 蟲(chóng)。本打算換液，換液前特意看了下前些天配的培養液，肉眼發(fā)現培養液中有懸浮的顆粒狀物質(zhì)(不多)，于是放在鏡 下觀(guān)察，新鮮培養液中有一些懸浮的小顆粒，不多。(培養液是R1640+20%牛血清+1%雙抗)于是又將分裝在4℃保存的 小牛血清拿出觀(guān)察，肉眼可見(jiàn)5、6個(gè)白色小小球狀的物質(zhì)，在血清瓶稍靠下的部位懸浮。鏡下觀(guān)察，也有少量的不知 什么物質(zhì)的東西漂浮。小牛血清是Hyclone新西蘭的，標簽上寫(xiě)已經(jīng)經(jīng)過(guò)2μm濾膜過(guò)濾處理。根據上述培養液的情 況，是否說(shuō)明培養液已被污染？如果是正常的血清是不是在鏡下不應該看到雜物，哪怕是極少量的？根據上述血清的 描述，是不是說(shuō)明血清也存在問(wèn)題，還能用嗎？補充：細胞培養以來(lái)生長(cháng)狀態(tài)就不好。買(mǎi)血清的時(shí)候廠(chǎng)家說(shuō)明不用滅 活，所以未滅活。

答：(1)血清應該-20℃保存，解凍血清時(shí)，請按照的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時(shí)改變 的溫度太大實(shí)驗顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。

(2)BI胎牛血清(Bioind胎牛血清)中沉淀物的出現有許多種原因，但普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白 在血清解凍后，也會(huì )存在于血清中，亦可造成沉淀物。

(3)若您一次無(wú)法用完一瓶，建議您無(wú)菌分裝血清，再放回冷凍，若存放于4℃時(shí)，請勿超過(guò)一個(gè)月，儲存 在2－8℃時(shí)，血清中的各種蛋白和脂蛋白，可能聚集而形成沉淀或可見(jiàn)的混濁。

(4)解凍血清時(shí)，請隨時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

(5)排出了血清的原因，在考慮實(shí)驗用品和無(wú)菌操作的問(wèn)題。

(6)細菌病毒、衣原體、黑膠蟲(chóng)污染也很常見(jiàn)，如果細胞死的太多，影響較大建議更換培養液。

2、問(wèn)：今天在配培養液時(shí)，發(fā)現血清里面有小碎片樣的漂浮物，血清仍然清亮，不渾濁。不知道是什么， 問(wèn)了實(shí)驗室的學(xué)長(cháng)，說(shuō)仍然可以用，但還是不放心，沒(méi)有用血清。求助園子的各位達人，這可能是血清出了什么問(wèn)題 ？我的血清用了一個(gè)月不到，四季青的。

答：可能的原因：(1)培養液配置時(shí)Votex不夠，當時(shí)是清亮的，但過(guò)一段時(shí)間會(huì )析出來(lái)；(2)真菌污染。

十九、更換無(wú)血清培養基后細胞大量死亡的問(wèn)題。

問(wèn)：我使用Lipofectamine2000轉染成骨細胞，在轉染前要換上無(wú)血清的培養基。本來(lái)條件模的好好的，轉 染效率也可以接受。但是寒假一回來(lái)就發(fā)生了怪事：細胞在有血清的培養基中長(cháng)的好好的，一換無(wú)血清的培養基就死 亡。大概4個(gè)小時(shí)就能看到較多的細胞飄起來(lái)。但是原來(lái)我換無(wú)血清培養基，就算放那里10個(gè)小時(shí)都是沒(méi)問(wèn)題的啊。 已經(jīng)換了不同批次的培養基，甚至吸管什么的都換過(guò)了，但是就是不行，是怎么回事？

答：(1)兩周后的培養液應補加谷氨酰胺，或者重新配液，轉染時(shí)應不含抗生素。

(2)確認操作方法和環(huán)境，建議檢查一下。

(3)Lipofectamine2000，脂質(zhì)體的毒性很大，如果有質(zhì)粒參與對細胞損傷更大，如果Lipofectamine2000 在常溫放置過(guò)，對細胞更大，假期冰箱是否斷過(guò)電。

(4)培養箱的溫度、c02濃度，濕度。

二十、*培養液的相關(guān)定義。

問(wèn)：“*培養液一詞”，是指加了血清的培養液?jiǎn)?？我在做含藥血清的?shí)驗，涉及到BI胎牛血清(Bioind胎牛血清)添加量的問(wèn)題。所以想弄明白文中所指的“*培養液”是否是含藥血清。

答：原液是指配置后過(guò)濾除菌。不*培養液是指不含有血清的原液，其他成分已補充。*培養液是指 不*培養液加入血清后稱(chēng)*培養液。

二十一、血清相關(guān)知識總結。

使用BI胎牛血清的注意事項：

血清是細胞培養中重要的元素之一。下面是實(shí)驗室里常會(huì )遇到的問(wèn)題，僅供大家參考：

1、保存血清的方法：

建議血清應保存在-5℃ 至 -2O ℃ 。然而，若存放于 4 ℃ 時(shí)，請勿超過(guò)一個(gè)月。若您一次無(wú)法用完一瓶 ，建議您無(wú)菌分裝血清至恰當的滅菌容器內，再放回冷凍。

2、如何解凍血清才不會(huì )使產(chǎn)品質(zhì)量受損：

建議您將血清從冷凍箱取出后，先置于2～8℃ 冰箱使之溶解，然后在室溫下使之全溶。但必須注意的是， 溶解過(guò)程中必須規則地搖晃均勻。

3、BI北美胎牛血清解凍后發(fā)現有絮狀沉淀物出現，該如何處理：

血清中沉淀物的出現有許多種原因，但普的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白(形成 凝血的蛋白之一)在血渭解凍后，也會(huì )存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影 響血清本身的質(zhì)量。

若您欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無(wú)菌離心管內，以400g稍微離心，上清液即可接著(zhù)加入培 養基內一起過(guò)濾。我們不建議您以過(guò)濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因為它可能會(huì )阻塞您的過(guò)濾膜。

4、何謂熱滅活：

一般是以 56℃ ， 30 分鐘來(lái)處理已解凍的血清，因為此加熱步驟，可以使補體去活化，而補體所參與的 反應有 : 溶細胞活性，平滑肌的收縮，肥大細胞和血小板組胺的釋放，增強吞噬作用，淋巴細胞、巨噬細胞的趨化 和激活。

5、關(guān)于胎牛血清的滅活：

有必要做熱滅活嗎？

實(shí)驗顯示，經(jīng)過(guò)正確處理的熱滅活血清，對大多數的細胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過(guò)的血清對細胞的生 長(cháng)只有微小的促進(jìn)，或*沒(méi)有任何作用，甚至通常因為高溫處理影響了血清的質(zhì)量，而造成細胞生長(cháng)速率的降低。 而經(jīng)過(guò)熱處理的血清，沉淀物的形成會(huì )顯著(zhù)的增多，這些沉淀物在倒立顯微鏡下觀(guān)察，像是“小黑點(diǎn)” ，常常會(huì )讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在 37℃ 環(huán)境中，又會(huì )使此沉淀物更增多，使研究者誤認為是 微生物的分裂擴增。

因此我們建議您，若非必須，您可以不需要做熱處理這一步。如此一來(lái)，不但節省您寶貴的時(shí)間，更確保 您血清的質(zhì)量！

6、BI胎牛血清(Bioind胎牛血清)相關(guān)知識：

如何避免沉淀物的產(chǎn)生？

我們建議您在使用血清的時(shí)候，注意下列的操作 :

(1)解凍血清時(shí)，請按照所建議的逐步解凍法(-2O℃至4℃至室溫)，若血清解凍時(shí)改變的溫度太大(如-20℃ 至37℃)，實(shí)驗顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。

(2)解凍BI胚胎干細胞血清時(shí)，請隨時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

(3)請勿將BI間充質(zhì)干細胞血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會(huì )變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩定的成分也會(huì ) 因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。

(4)血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無(wú)須做此步驟。

(5)若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30 分鐘的原則，并且隨時(shí)搖晃均勻。溫度過(guò)高，時(shí)間過(guò)久或搖 晃不均勻，都會(huì )造成沉淀物的增多。