免疫熒光實(shí)驗的主要步驟包括細胞片制備、固定及通透（或稱(chēng)為透化）、封閉、抗體孵育及熒光檢測等。細胞片制備（通俗的說(shuō)法是細胞爬片）是免疫熒光實(shí)驗的第一步，細胞片的質(zhì)量對實(shí)驗的成敗至關(guān)重要，原因很簡(jiǎn)單，如果發(fā)生細胞掉片，一切都無(wú)從談起。這一步關(guān)鍵的是玻片（Slides or Coverslips）的處理以及細胞的活力，有人根據成功經(jīng)驗總結出許多有益的細節或小竅門(mén)，非常值得借鑒。固定和通透步驟最重要的是根據所研究抗原的性質(zhì)選擇適當的固定方法，合適的固定劑和固定程序對于獲得好的實(shí)驗結果是非常重要的。免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步驟是類(lèi)似的，最重要的區別在于免疫熒光實(shí)驗中要用到熒光抗體，因此必須謹記避光操作，此外抗體濃度的選擇可能更加關(guān)鍵。最后需要注意的是，標記好熒光的細胞片應盡早觀(guān)察，或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因標記蛋白解離或熒光減弱而影響實(shí)驗結果。

由于操作步驟比較多，同時(shí)在分析結果時(shí)無(wú)法像WB那樣可以根據分子量的大小區分非特異性識別，所以要得到一個(gè)免疫熒光實(shí)驗結果，除了需要高質(zhì)量的抗體，以及對實(shí)驗條件進(jìn)行反復優(yōu)化外，還必須設立嚴謹的實(shí)驗對照?？傊?，免疫熒光實(shí)驗從細胞樣品處理、固定、封閉、抗體孵育到最后的封片及觀(guān)察拍照，每步都非常關(guān)鍵，需要嚴格控制實(shí)驗流程中每個(gè)步驟的質(zhì)量，才能最終達到你的實(shí)驗目的。