1) 引物用量偏大，引物的特異性不高。應調換引物或降低引物的使用量。

2) 循環(huán)的次數過(guò)多。適當增加模板的量，減少循環(huán)次數。

3) 酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好。應降低酶量或調換另一來(lái)源的酶。

4) 退火溫度偏低，退火及延伸時(shí)間偏長(cháng)。應提高退火溫度，減少變性與延伸時(shí)間，也可采用二種溫度的PCR擴增。以2度為梯度設計梯度PCR反應優(yōu)化退火溫度。

5) 樣品處理不當。

6) Mg2+濃度偏高。因適當調整Mg2+使用濃度。

7) 若為PCR試劑盒。也可能時(shí)試劑盒本身質(zhì)量有問(wèn)題。

8) 復制提前終止。使用非熱啟動(dòng)的聚合酶時(shí)常有發(fā)生。冰上準備反應體系或采用熱啟動(dòng)聚合酶。

9) 反應緩沖液未*融化或未充分混勻。確保反應緩沖液融化*并*混勻。

10) 引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。

11) 引物量過(guò)多。減少反應體系中引物的用量。

12) 模板量過(guò)多。質(zhì)粒DNA的用量應<50ng，而基因組DNA則應<200ng。

13) 外源DNA污染。確保操作的潔凈。