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細胞轉染的原理、操作步驟
  • 發(fā)布日期:2023-05-08      瀏覽次數:529
    • 細胞轉染的方法主要包括:電穿孔法、磷酸鈣沉淀法、脂質(zhì)體轉染法、病毒介導的轉染等,理想的細胞轉染方法是具有高轉染效率、對細胞的毒性作用小等,本文主要介紹細胞轉染常用的方法-脂質(zhì)體轉染的原理和操作步驟。

      脂質(zhì)體(Liposome)轉染方法原理:
      脂質(zhì)體作為體內和體外輸送載體的工具,已經(jīng)研究的十分廣泛,中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA,借助脂質(zhì)膜將DNA導入細胞膜內。帶正電的陽(yáng)離子脂質(zhì)體,DNA并沒(méi)有預先包埋在脂質(zhì)體中,而是帶負電的DNA自動(dòng)結合到帶正電的脂質(zhì)體上,形成DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復合物,從而吸附到帶負電的細胞膜表面,經(jīng)過(guò)內吞被導入細胞。 優(yōu)點(diǎn):與其它方法相比,有較高的效率和較好的重復性,它適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中,是目前條件下的轉染方法之一。

      脂質(zhì)體轉染操作步驟
      (1)細胞培養:取6cm細胞皿,向每孔中加入2mL含1~2×105個(gè)細胞培養液,37℃ CO2培養密度至40%~60%,密度過(guò)大,轉染后不利篩選細胞。
      (2) 轉染液制備:在EP管中制備以下兩液(為轉染每一個(gè)孔細胞所用的量) A液:用不含血清培養基稀釋1ug 質(zhì)粒DNA。 B液:用不含血清培養基稀釋2ul脂質(zhì)體。 分別將A液與B液輕彈混勻,靜置5分鐘。
      (3)吸取B液加入至A液中,輕彈混勻。室溫中置10-15分鐘。
      (4)轉染準備:用1mL不含血清培養液漂洗兩次,再加入4mL不含血清培養液。
      (5)轉染:把A/B復合物緩緩加入培養液中,搖勻,37℃溫箱置6~24小時(shí),吸除無(wú)血清轉染液,換入正常培養液繼續培養。
      (6)瞬時(shí)轉染后,可在48h-72h細胞長(cháng)滿(mǎn)之后,提取細胞蛋白或者RNA,驗證敲減/過(guò)表達效率。

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