1、冰凍切片固定

冰凍切片37℃烘烤10至20分鐘，控干水分，置于4%多聚甲醛固定30min。于PBS緩沖液中晃動(dòng)洗滌3次，每次5分鐘。

2、抗原修復

將切片浸沒(méi)在升滿(mǎn)EDTA抗原修復緩沖液（PH8.0）的修復盆中，置于微波爐內進(jìn)行抗原修復，修復條件：中火8min至沸——?；?min保溫——中低火7min（整個(gè)過(guò)程需防止修復液過(guò)度蒸發(fā)，切勿干片。

自然冷卻后，將切片置于PBS緩沖液中。然后在搖床上，晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

3、畫(huà)圈血清封閉

切片稍甩干后，用組化筆在組織周?chē)?huà)圈，滴加組織自發(fā)熒光淬滅劑A液，室溫孵育30min，純水洗5分鐘，接著(zhù)滴加BSA牛血清白蛋白，封閉30min。

4、加一抗

輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加按比例配好的一抗后，切片平放于濕盒內4℃孵育過(guò)夜，這里推薦使用生科云選一抗實(shí)驗效果更佳。

5、加二抗

切片浸沒(méi)在PBS緩沖液中，然后在生科云選搖床上，晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后，滴加生科云選熒光二抗，覆蓋組織，避光室溫孵育50min。這里推薦使用生科云選二抗實(shí)驗效果更佳。

6、DAPI復染細胞核

切片浸沒(méi)在生科云選PBS緩沖液中，晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。甩干后，在圈內滴加生科云選即用型DAPI染液，避光室溫孵育10min。

7、淬光組織自發(fā)熒光

切片置于生科云選PBS緩沖液中，晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。在圈內滴加生科云選組織自發(fā)熒光淬滅劑B液，避光室溫孵育5min，水洗10min。

8、封片

切片稍甩干后用生科云選抗熒光淬滅封片劑封片，推薦使用生科云選配套試劑、耗材、儀器，實(shí)驗效果更佳！

冰凍切片免疫熒光結果判讀：

DAPI染出來(lái)的細胞核在紫外的激發(fā)下為藍色，陽(yáng)性表達為相應熒光素標記的紅光或綠光等。