一、原理： CCK-8試劑盒用于快速靈敏地檢測細胞增殖和細胞毒性。工作原理為：在電子耦合試劑存在的情況下，WST-8（化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽），可以被線(xiàn)粒體內的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物（formazan），其顏色的深淺與細胞增殖成正比，與細胞毒性成反比，對同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數目呈線(xiàn)性關(guān)系。使用酶標儀在450nm波長(cháng)處測定OD值，可以間接反映活細胞的數量。

二、用途：可用于細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗等。

三、實(shí)驗步驟：

1.種板數：根據你摸索的，或者查閱文獻確定你需要的種板濃度，根據種板濃度對細胞懸液進(jìn)行稀釋?zhuān)ǔ＜毎鲋硨?shí)驗每孔加入約1000-2000個(gè)細胞100ul，細胞毒性實(shí)驗每孔加入約5000～10000個(gè)細胞100ul（具體每孔所用的細胞的數目，需根據細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。

2.種板：以96孔板為例，96孔板橫向是1-12的數字，縱向是A-H，可做多個(gè)實(shí)驗組，每組設置4-6個(gè)復孔，同時(shí)設置空白組，最邊緣孔加入PBS緩沖液減少蒸發(fā)帶來(lái)的影響，然后將細胞置于37℃ 5%CO2細胞培養箱中培養12-24 h。

3.加藥及加藥后孵育時(shí)間：觀(guān)察細胞細胞貼壁良好，吸出各孔培養基，實(shí)驗組加入含不同濃度藥物的培養基，空白組加入不含藥物培養基，然后將96孔板在37℃ 5% CO2空氣的細胞培養箱中孵育適當時(shí)間，根據不同實(shí)驗細胞需求選擇適當的孵育條件和時(shí)間。

4.加入CCK-8：兩種方法，每孔直接加入10ul的CCK-8溶液,或者配置成含10%CCK-8溶液的培養基以換液的形式加入,注意加入過(guò)程中避免產(chǎn)生氣泡，可以將槍頭浸入培養液中緩慢加入。

5.加入CCK-8后孵育時(shí)間：將加完CCK-8的培養板放入37°C 5%CO2 培養箱中孵育1-4h，CCK-8試劑加入后孵育時(shí)間也需要自己摸索，隨著(zhù)時(shí)間的增加，OD值就會(huì )增大?？梢栽?.5h、1.0h、2.0h分別測OD值，把OD值控制在1.0左右。

6.測OD值：將96孔板取出，酶標儀檢測各孔在450nm波長(cháng)處的OD值，分析處理數據，繪制增殖曲線(xiàn)。