1、凍存細胞的效果好壞要看細胞復蘇時(shí)的存活率。細胞凍存時(shí)，細胞內部會(huì )產(chǎn)生晶體，水凝固形成的高濃度溶質(zhì)會(huì )對細胞產(chǎn)生損傷，所以在凍存過(guò)程中要盡可能降低晶體的產(chǎn)生。為了提高復蘇存活率，可通過(guò)以下方法完成：

a.降溫的速度不能太快，讓細胞內的水分緩慢離開(kāi)細胞；

b.在低溫環(huán)境下凍存細胞可以降低高濃度鹽對細胞中蛋白質(zhì)的影響；

c.凍存試劑要采用親水的低溫保護劑；

d.復蘇時(shí)的速度要快，這樣可以減少細胞內部冰晶溶解時(shí)產(chǎn)生的某些可溶性成分。

2、凍存細胞是為了留種，所以要選擇高濃度的細胞量進(jìn)行凍存。正常情況下，當細胞濃度達到1*105/ml時(shí)即可凍存，具體是多少量主要根據個(gè)人觀(guān)察。

3、二甲基亞砜（DMSO)因為穿透細胞的能力較強，因此作為常用的凍存劑，也可以叫做細胞保護劑加入到細胞懸液中。網(wǎng)上有些分享說(shuō)道，如果選用DMSO，整個(gè)細胞懸液的制作過(guò)程都要在4℃環(huán)境下進(jìn)行。本人采用過(guò)這種方法凍存過(guò)A549和某一原代細胞，發(fā)現A549復蘇存活率和正常凍存的過(guò)程相比并沒(méi)有明顯區別，而原代細胞的接種率確實(shí)有所上升，可能是因為是A549細胞比較皮實(shí)，這種方法更適用于比較脆弱的細胞吧。

4、凍存液比例一般是培養基：血清：DMSO=7:2:1或5:4:1；動(dòng)物種屬的原代細胞凍存液可采用的比例是培養基：血清：DMSO=0:9:1，即直接用血清重懸細胞再加入DMSO，盡管如此，原代細胞的復蘇成活率還是很低。

5、有文獻表明，細胞以l℃/min的速度冷凍存活率最髙，因為這一速度可以很好的控制細胞內部晶體的產(chǎn)生。我們實(shí)際操作不可能將速度控制的這么精確，目前慣用的就是4℃30min、-20℃1h30min、-80℃2h后轉入液氮中。

6、正常情況下，經(jīng)過(guò)-20℃1h30min這一步后，凍存管內的細胞已經(jīng)處于凝固狀態(tài)，如果此時(shí)凍存管內還是液體，很可能是DMSO或冰箱冷凍功能出現了問(wèn)題。如若遇到這種情況，不能因為時(shí)間到了，就把把液體狀態(tài)的凍存管放置到液氮中，可以適當延長(cháng)在-20℃環(huán)境下的冷凍時(shí)間30-60分鐘，直至凍存液凝固后再放到液氮中。

7、凍存記錄要表明細胞的種類(lèi)、凍存之前的狀態(tài)和大致數量、凍存時(shí)間和操作者。

8、液氮內的細胞凍存最長(cháng)時(shí)間不要超過(guò)半年，凍存在液氮中的細胞應一段時(shí)間內進(jìn)行更替。一個(gè)細胞系在培養一個(gè)月后，可復蘇一管新的細胞確保其質(zhì)量沒(méi)有發(fā)生太大變化，傳代幾次后，再凍存留種。

9、細胞復蘇時(shí)，為保證獲得較高的存活率和接種率，應盡可能的快速完成復蘇，以避免在升溫過(guò)程中細胞內部晶體的產(chǎn)生。書(shū)面介紹的復蘇溫度是37℃-42℃，但是本人在實(shí)際操作中發(fā)現40℃環(huán)境下復蘇。

10、復蘇時(shí)的凍存管一定要密封好，以免管內外溫度和壓力不同導致凍存管炸裂。

11、復蘇時(shí)使用的培養基和凍存時(shí)使用的培養基中的血清盡量保證同一批次。

12、DMSO快速稀釋會(huì )對細胞造成滲透性損傷，使存活率下降50%。對于DMSO凍存的細胞，復蘇后應緩慢稀釋成細胞懸液：

1.凍存液：培養基=1:1稀釋成細胞懸液后離心，然后重懸至培養皿中培養，隔天換液。

2.凍存液：培養基=1:10稀釋成細胞懸液，不用離心，直接放置到培養瓶中培養2-4小時(shí)后，換液。上述兩種方法都是比較常用的細胞復蘇方法，后者更適用于原代細胞或比較難養的細胞。