原理：
凝膠過(guò)濾層析是利用具有多孔網(wǎng)狀結構的顆粒的分子篩作用，根據被分離樣品中各組分相對分子質(zhì)量大小的差異進(jìn)行洗脫分離的一項技術(shù)。
凝膠過(guò)濾層析(gel filtration chromatography)法又稱(chēng)為排阻層析或分子篩方法，主要是根據蛋白質(zhì)的大小和形狀，即蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行分離和純化。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網(wǎng)狀結構物質(zhì)，多是交聯(lián)的聚糖（如葡聚糖或瓊脂糖）類(lèi)物質(zhì)，使蛋白質(zhì)混合物中的物質(zhì)按分子大小的不同進(jìn)行分離。也叫做分子排阻層析（molecular-exclusion chromatography）。一種利用帶孔凝膠珠作基質(zhì)，按照分子大小分離蛋白質(zhì)或其它分子混合物的層析技術(shù)。 一般是大分子先流出來(lái)，小分子后流出來(lái)。

使用方法：
⒈凝膠的選擇根據實(shí)驗目的不同選擇不同型號的凝膠。如果實(shí)驗目的是將樣品中的大分子物質(zhì)和小分子物質(zhì)分開(kāi)，由于它們在分配系數上有顯著(zhù)差異，這種分離又稱(chēng)組別分離，一般可選用SephadexG-25和G-50，對于小肽和低分子量的物質(zhì)（1000-5000）的脫鹽可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果實(shí)驗目的是將樣品中一些分子量比較近似的物質(zhì)進(jìn)行分離，這種分離又叫分級分離。一般選用排阻限度略大于樣品中最高分子量物質(zhì)的凝膠，層析過(guò)程中這些物質(zhì)都能不同程度地深入到凝膠內部，由于Kd不同，最后得到分離。

⒉柱的直徑與長(cháng)度根據經(jīng)驗，組別分離時(shí)，大多采用2-30cm長(cháng)的層析柱，分級分離時(shí)，一般需要100cm左右長(cháng)的層析柱，其直徑在1-5cm范圍內，小于1cm產(chǎn)生管壁效應，大于5cm則稀釋現象嚴重。長(cháng)度L與直徑D的比值L/D一般宜在7-10之間，但對移動(dòng)慢的物質(zhì)宜在30-40之間。

⒊凝膠柱的制備凝膠型號選定后，將干膠顆粒懸浮于5-10倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之后將極細的小顆粒傾瀉出去。自然溶脹費時(shí)較長(cháng)，加熱可使溶脹加速，即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸，1-2小時(shí)即可達到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節省時(shí)間又可消毒。
凝膠的裝填：將層析柱與地面垂直固定在架子上，下端流出口用夾子夾緊，柱頂可安裝一個(gè)帶有攪拌裝置的較大容器，柱內充滿(mǎn)洗脫液，將凝膠調成較稀薄的漿頭液盛于柱頂的容器中，然后在微微地攪拌下使凝膠下沉于柱內，這樣凝膠粒水平上升，直到所需高度為止，拆除柱頂裝置，用相應的濾紙片輕輕蓋在凝膠床表面。稍放置一段時(shí)間，再開(kāi)始流動(dòng)平衡，流速應低于層析時(shí)所需的流速。在平衡過(guò)程中逐漸增加到層析的流速，千萬(wàn)不能超過(guò)最終流速。平衡凝膠床過(guò)夜，使用前要檢查層析床是否均勻，有無(wú)“紋路"或氣泡，或加一些有色物質(zhì)來(lái)觀(guān)察色帶的移動(dòng)，如帶狹窄、均勻平整說(shuō)明層析柱的性能良好，色帶出現歪曲、散亂、變寬時(shí)必須重新裝柱。

⒋加樣和洗脫凝膠床經(jīng)過(guò)平衡后，在床頂部留下數亳升洗脫液使凝膠床飽和，再用滴管加入樣品。一般樣品體積不大于凝膠總床體積的5%-10%。樣品濃度與分配系數無(wú)關(guān)，故樣品濃度可以提高，但分子量較大的物質(zhì)，溶液的粘度將隨濃度增加而增大，使分子運動(dòng)受限，故樣品與洗脫液的相對粘度不得超過(guò)1.5-2.樣品加入后打開(kāi)流出口，使樣品滲入凝膠床內，當樣品液面恰與凝膠床表面相平時(shí)，再加入數毫升洗脫液中洗管壁，使其全部進(jìn)入凝膠床后，將層析床與洗脫液貯瓶及收集器相連，預先設計好流速，然后分部收集洗脫液，并對每一餾份做定性、定量測定。

⒌凝膠柱的重復使用、凝膠回收與保存一次裝柱后可以反復使用，不必特殊處理，并不影響分離效果。為了防止凝膠染菌，可在一次層析后加入0.02%的疊氮鈉，在下次層析前應將抑菌劑除去，以免干擾洗脫液的測定。