ELISA檢測系統可謂是免疫學(xué)反應應用到科研生產(chǎn)中為廣泛的是靈敏的技術(shù)手段?？墒窃谛吕鲜植僮鬟^(guò)程中總是會(huì )出現或大或小的問(wèn)題，比如說(shuō)花板，假陽(yáng)性，全顯色，全部顯色，顯色比空白還低.....。聯(lián)碩生物為您總結7步ELISA檢測實(shí)驗經(jīng)驗，做好這7步您就能得出實(shí)驗結果。

1、包被原的性質(zhì)很重要，蛋白濃度，是否降解，這關(guān)系到你做出的抗體可不可以被其識別，所以保存抗原很重要，我做重組蛋白時(shí)，師兄都嚴格警告我一定要在冰浴下緩慢融化就是這個(gè)道理。還有有的包被原可能不是蛋白，對于生物素和脂類(lèi)物質(zhì)或小分子物質(zhì)我們要事先對其改造再加以包被，方法簡(jiǎn)要的列出如下:
①親和素生物素:先親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。
②脂類(lèi)物質(zhì):可將其在有機溶劑(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中，開(kāi)蓋置冰箱過(guò)夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。
③小分子必須依靠和大的蛋白載體偶聯(lián)后才能固定在固相載體上。

2、包被液的選擇，一般選擇ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時(shí)由于試驗的需要，包被原的特殊性也可能采用中性的緩沖溶液來(lái)包。應注意以下原理：由于蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用，這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。具體的試驗還要有堅固的理論外也要實(shí)踐，看一下可不可以應用到自己試驗當中去。常用的包被液除了剛才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液，還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。

3、封閉：繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑有：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉，比較價(jià)廉，可以高濃度使用(5%-10%);還有一些稀有用到的各種動(dòng)物血清(主要為了排除相似蛋白干擾)和酪蛋白等等。但選用什么，要依據試驗具體來(lái)實(shí)踐。

4、洗滌板：可以說(shuō)在ELISA操作中，洗滌是主要的關(guān)鍵技術(shù)。因為聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，為達到分離游離的和結合的酶標記物的目的，清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)，在洗滌時(shí)又應把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。所以在洗板時(shí)會(huì )有一定誤差，人為因素很大(當然有條件的用洗板機除外)，洗的不*或串了孔，對如此靈敏的ELISA系統可是不小的影響。

5、加抗體標本(和二抗):注意該換槍頭時(shí)換槍頭。標本稀釋一般可用PBS稀釋?zhuān)部捎梅忾]液去稀釋。如需加二抗，還要注意二抗的工作濃度，太高浪費，太低則著(zhù)色淺。

6、顯色：顯色系統又很多，我們一開(kāi)始做的時(shí)候，要選擇適宜的顯色系統。注意顯色系統酶活性底物的保存HRP結合物加硫柳泵，AP結合物可加疊氮鈉。

7、每次做盡量要把陰陽(yáng)空三個(gè)對照做好，如出現問(wèn)題也好分析。