在PCR實(shí)驗過(guò)程中，我們經(jīng)常會(huì )遇到各種奇特的擴增曲線(xiàn)，如何正確解讀這些曲線(xiàn)并且做出恰當的解決方案是我們一線(xiàn)實(shí)驗者需要練就的基本功。今兒，將多年累積的功力編成“武功秘籍”奉上，助你PK掉那些令人犯暈的異常曲線(xiàn)。

異常曲線(xiàn)1：PCR擴增抑制

原因分析：H07存在擴增抑制

解決方案：將樣本稀釋后進(jìn)行擴增（抑制物的影響可通過(guò)稀釋樣本消除

異常曲線(xiàn)2：自動(dòng)基線(xiàn)設置問(wèn)題

原因分析：自動(dòng)基線(xiàn)問(wèn)題

解決方案：手動(dòng)設置基線(xiàn)。將Baseline End設置為“擴增信號出現的前一個(gè)循環(huán)”即，圖片展原始為26，將其設置為20，點(diǎn)擊OK即可恢復正常曲線(xiàn)。

異常曲線(xiàn)3：熒光定量PCR實(shí)驗結果中無(wú)Ct值出現

原因分析：

（1）PCR參數設置錯誤：在設計循環(huán)參數時(shí)沒(méi)有設置熒光信號采集；

（2）模板降解: 避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復凍融的情況；

（3）引物或者探針降解：可通過(guò)PAGE電泳檢測其完整性；

（4）電腦設置了自動(dòng)休眠。

解決方案：按照原因分析進(jìn)行一一核查，對癥處理。

異常曲線(xiàn)4：斜直線(xiàn)型擴增曲線(xiàn)

PCR實(shí)驗*檢測呈斜直線(xiàn)型擴增曲線(xiàn)，再次復檢后結果基本均為正常陰性。

原因分析：

分液不準確，檢查檢測后的反應管可發(fā)現管內的PCR反應液量明顯少于正常管；反應管氣密性差，反應過(guò)程中溶液蒸發(fā)引起探針濃度增加，導致曲線(xiàn)呈斜直線(xiàn)狀。

解決方案：分液均勻，上機前檢查八連管液面是否在同一水平線(xiàn)上；八連管蓋蓋嚴，上機前檢查是否有縫隙。

異常曲線(xiàn)5：擴增曲線(xiàn)末尾起跳

PCR實(shí)驗結果中有曲線(xiàn)出現末尾起跳但是沒(méi)有完整擴增的現象。

原因分析：

（1）陰參曲線(xiàn)末尾起跳，通常表示存在污染；

（2）復檢樣本，排除非特異性擴增的可能性；

（3）正常樣本也可存在曲線(xiàn)末尾起跳，表示樣本濃度低或者加樣量不準確。

解決方案：排除是否存在污染；排除污染原因后復檢樣本，如果復檢后曲線(xiàn)為陰性直線(xiàn)則說(shuō)明之前的末尾起跳為非特異性擴增，如果復檢后曲線(xiàn)仍與之前一致則說(shuō)明末尾起跳表示該樣本中待檢病毒核酸的濃度偏低。

異常曲線(xiàn)6：山域型曲線(xiàn)

原因分析：嚴重的蒸發(fā)會(huì )呈現先上升后下降的曲線(xiàn)，輕微的蒸發(fā)會(huì )是一種緩慢的上升，這兩類(lèi)異常的曲線(xiàn)可以看一下檢測后的反應管液面是否有下降的現象來(lái)證明。

解決方案：上機檢測前檢查八連管管蓋，保證無(wú)縫隙后上機擴增。

異常曲線(xiàn)7：擴增曲線(xiàn)有向上或者向下的尖峰

原因分析：

（1）儀器不穩定導致的擴增曲線(xiàn)異常（也可能突然停電或者電壓不穩）；

（2）如果尖峰向下，可能是鹵素燈老化所致發(fā)射光源不穩定（指鹵鎢燈光源的激發(fā)器）

（3）如果是單一的孔位出現尖峰，除了考慮儀器或者孔位問(wèn)題外，還要考慮反應體系是否有氣泡所致。

解決方案：按照原因分析進(jìn)行一一核查，對癥處理。

背景知識

判斷擴增曲線(xiàn)是否良好的指標

1.曲線(xiàn)拐點(diǎn)清楚，特別是低濃度樣本指數期明顯，擴增曲線(xiàn)整體平行性好，基線(xiàn)平而無(wú)上揚現象，低濃度樣本擴增曲線(xiàn)指數期明顯。

2.曲線(xiàn)指數期斜率與擴增效率成正比，斜率越大擴增效率越高。

3.標準的基線(xiàn)平直或略微下降，無(wú)明顯的上揚趨勢。

4.各管的擴增曲線(xiàn)平行性好，表明各反應管的擴增效率相近。