透析胎牛血清使用中的常見(jiàn)問(wèn)題 1、 如何儲存和解凍
透析胎牛血清才不會(huì )使產(chǎn)品質(zhì)量受損?
將血清從冷凍箱取出后,先置于2~8℃冰箱使之融解,然后在室溫下使之全融。但必須注意的是,融解過(guò)程中必須規則地搖晃均勻。
長(cháng)時(shí)間儲存在2-8℃時(shí),血清中的各種蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可見(jiàn)的混濁。因此,推薦在-20℃以下儲存血清,并避免反復凍融。
我們建議血清應保存在-2O℃。若存放于4℃時(shí),請勿超過(guò)一個(gè)月。若一次無(wú)法用完一瓶,建議無(wú)菌分裝血清至恰當的滅菌容器內,再放回冷凍。
2、血清中包含絮狀沉淀,它們是什么,怎么處理?
沉淀包含纖維蛋白和脂蛋白。這是正常特性,不會(huì )影響產(chǎn)品性質(zhì)。要除去沉淀,離心血清(400g,1-2分鐘)或者簡(jiǎn)單的讓其沉淀在瓶子底部,將血清小心的轉移到另一個(gè)無(wú)菌瓶里(一般不建議采用過(guò)濾的方法除去沉淀,因為沉淀會(huì )堵塞濾膜而無(wú)法過(guò)濾)。大多情況輕輕搖動(dòng)沉淀并加熱至37℃就會(huì )再溶解。所以,使用產(chǎn)品時(shí)要搖動(dòng)并加熱血清至37℃,沉淀會(huì )自然消失。
3、實(shí)驗室如何選擇適合的血清?
國內一致認為HYCLONE的血清是的,但是根據我在北美的經(jīng)歷,國外一般認為GIBCO比HYCLONE好,所以并不是價(jià)格決定質(zhì)量,但是總的來(lái)說(shuō)這兩種價(jià)格普遍偏貴,一般不是太嬌氣的細胞,國產(chǎn)的就夠用了。此外,由于國內HYCLONE,GIBCO并沒(méi)有生產(chǎn)線(xiàn),我們只能從代理商那里買(mǎi),而代理商又魚(yú)龍混雜,所以買(mǎi)到假貨的可能性也很大。所以,我一般會(huì )從直銷(xiāo)員那里買(mǎi)血清,有的國外生物公司由于剛剛進(jìn)入中國,度不高,但是其實(shí)在國外已經(jīng)做得很不錯了,如Wisent等,他們在國內有辦事處,我會(huì )從那里拿,血清的品質(zhì)和HYCLONE不相上下,但價(jià)格相對優(yōu)惠很多。
4、 如何避免血清中產(chǎn)生沉淀?
按如下操作可避免沉淀的產(chǎn)生:
(1)解凍血清時(shí),請隨時(shí)將之搖晃均勻,使溫度及成分均一,減少沉淀的發(fā)生。
(2) 血清分裝凍存時(shí),須規則搖晃均勻(小心勿造成氣泡),使溫度與成分均一。
(3) 勿直接由-20℃直接至37℃解凍,因溫度改變太大,容易造成蛋白質(zhì)凝結而發(fā)生沉淀。
(4) 勿將透析胎牛血清置于37℃太久,否則血清會(huì )變得渾濁,同時(shí)血清中許多較不穩定的成份也會(huì )因此受到破壞,從而影響血清的品質(zhì)。
(5) 血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以無(wú)須做此步驟。
(6) 若必須做血清的熱滅活,請遵守56℃,30分鐘的原則,并且隨時(shí)搖晃均勻。溫度過(guò)高,時(shí)間過(guò)久或搖晃不均勻,都會(huì )造成沉淀物的增多。
5、 培養基中添加了血清和抗生素后,可長(cháng)期保存嗎?
一旦您在新鮮培養基中添加了血清和抗生素時(shí),您應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開(kāi)始降解。
6、 為什么要熱滅活血清?
加熱可以滅活補體系統。激活的補體參與溶解細胞事件,刺激平滑肌收縮,細胞和血小板釋放組胺,激活淋巴細胞和巨噬細胞。在免疫學(xué)研究,培養ES細胞、平滑肌細胞時(shí),推薦使用熱滅活血清。
7、 有必要做熱滅活嗎?
實(shí)驗顯示,經(jīng)過(guò)正確處理的熱滅活血清,對大多數的細胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過(guò)的血清對細胞的生長(cháng)只有微小的促進(jìn),或*沒(méi)有任何作用,甚至通常因為高溫處理影響了血清的質(zhì)量,而造成細胞生長(cháng)速率的降低。而經(jīng)過(guò)熱處理的透析胎牛血清,沉淀物的形成會(huì )顯著(zhù)的增多,這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀(guān)察,像是“小黑點(diǎn)”,常常會(huì )讓研究者誤以為是血清遭受污染,而把血清放在37℃環(huán)境中,又會(huì )使此沉淀物更增多,使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。
若非必須,可以不需要做熱處理這一步。不但節省時(shí)間,更確保血清的質(zhì)量!
8、細胞培養中出現黑點(diǎn)是污染嗎?如何處理?
一旦您在細胞培養的過(guò)程中發(fā)現有黑點(diǎn)生成,首先,要肉眼觀(guān)察培養基是否混濁,然后,在鏡下觀(guān)察培養細胞生長(cháng)的狀態(tài),黑點(diǎn)是否游動(dòng)。如果細胞被污染,微生物則會(huì )大量繁殖,培養基就會(huì )迅速變黃、變混濁。污染包括細菌污染、支原體污染等。
如果在鏡下觀(guān)察細胞,生長(cháng)狀態(tài)良好,與黑點(diǎn)出現前相比,沒(méi)有任何變化,那么,黑點(diǎn)的出現可能與以下幾種情況有關(guān):
(1)細胞生長(cháng)過(guò)老,破碎的細胞殘骸;
(2)血清質(zhì)量不好,反復凍融的結果;
(3)配制培養基的pH值偏高,不宜細胞生長(cháng);
(4)配制培養基的水質(zhì)、容器不合格??蓱秒x心、過(guò)濾的方法去除這些黑點(diǎn);
(5)培養原代細胞中出現小黑點(diǎn),可能是原代組織中的雜質(zhì),多次傳代可以消除。
9、 細胞培養中如何防止黑點(diǎn)生成?
(1) 盡可能地減少血清凍融次數。
(2) 培養基無(wú)需37℃水浴。
(3) 培養基保持*PH值7.0- 7.2。
(4) 嚴格控制配制培養基的水質(zhì),容器定期刷洗。
(5) 透析胎牛血清掌握細胞傳代的*時(shí)機,細胞切勿生長(cháng)過(guò)老。